仑昌硕生物   小鼠硝基酪氨酸（NT）elisa试剂盒

     目的: 观察铁调节蛋白2(Iron Regulatory Protein2,Irp2)基因敲除小鼠体内铁代谢和骨代谢的改变,探讨铁代谢紊乱在老年小鼠骨质疏松症发病中的作用及其机制. 方法: 本课题拟利用15月龄铁调节蛋白2基因敲除C57BL/6雌性小鼠(Irp2-/-,内源性铁过载模型)为研究对象,另外选择6只同月龄健康雌性野生型(Irp2+/+)小鼠作为对照组.取小鼠第6腰椎行Micro CT并三维重建;对第6腰椎进行骨组织切片,并行普鲁士蓝铁染色及HE染色,观察骨组织铁沉积情况和骨组织的结构变化;采用原子吸收光谱法检测小鼠第6腰椎骨铁,骨钙,骨磷以及小鼠肝铁含量;Realtime PCR法检测骨组织中铁代谢相关基因[膜铁转运蛋白1(Ferroportin-1, Fpn1),转铁蛋白受体1(Transferrin receptor-1, Tfr1),铁蛋白轻链(Ferritin light chain, Ftl),铁调素(Hepcidin)],及骨代谢相关基因[骨组织中碱性磷酸酶(Bone alkaline phosphatase, Balp),骨钙素(Bone Gla Protein, Bglap),Ⅰvs2.86±0.19μmol/L,P<0.001)和COLⅠα1(20.21±0.91 ng/ml vs24.98±2.04 ng/ml, P<0.001)等反映成骨细胞活性的指标显著降低,血清Ctsk(72.42±1.82μmol/L vs62.73±7.00μmol/L,P<0.05),Trap(40.63±2.43 U/L vs36.42±2.77 U/L,P<0.05)和CTX-1(2.74±0.33μmol/L vs2.19±0.42μmol/L,P<0.05)等反映破骨细胞活性的指标明显升高.与Irp2+/+组小鼠相比,Irp2-/-组小鼠25-羟化酶(CYP2R1)(1.21±0.18 ng/mg vs1.94±0.14 ng/mg, P<0.001)活性和血清25羟维生素D3[25(OH)D3](25.63±0.98μmol/L vs28.40±1.66μmol/L,P<0.01)水平显著降低.两组间血钙水平无明显差异. 结论: 1 Irp2基因敲除可导致小鼠体内铁代谢紊乱及铁分布异常(肝铁沉积严重,骨铁含量减少),小鼠骨组织内铁代谢相关基因及其蛋白的表达也发生了明显变化,以代偿Irp2-/-小鼠体内的铁代谢紊乱. 2两组小鼠均发生骨质疏松,Irp2-/-小鼠骨质疏松程度更加严重. 3铁代谢紊乱可加重骨质疏松症的发展.内源性铁过载引起的CYP2R1活性降低,以及后者引起的25(OH)D3水平降低,可能是Irp2-/-小鼠发生骨质疏松的重要原因之一.

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   维生素D需经过两步的酶促反应(25-羟基化作用和1α-羟基化作用),才能产生有活性的1α,25(OH)2D.其中,CYP2R1是生物体内催化维生素D的25-羟基化作用的关键酶,该过程是活性维生素D合成的重要环节.目前,国内外对小鼠CYP2R1的认识还非常有限,其蛋白结构,理化性质和病理学功能等也尚不清楚.此外,随着维生素D缺乏症的发生,维生素D的需求量增加,其生物学转化也具有广阔的应用前景,因此,维生素D 25-羟基化酶CYP2R1的相关研究显得尤为重要.本研究首先利用生物信息学软件对小鼠CYP2R1序列进行分析,为小鼠CYP2R1理化性质的研究及其定向改造提供参考;其次, 小鼠CYP2R1基因并在宫颈癌(Hela)细胞中进行表达,以构建真核高表达载体,为活性维生素D的生物学转化提供实验基础;此外,通过细胞划痕实验,MTT检测和qPCR检测,初步探讨小鼠CYP2R1对Hela细胞增殖的影响,为小鼠CYP2R1的相关功能研究提供了实验基础.主要结Arg131,Arg138,Lys434,Lys435,Arg445,Arg455.以结构明确的人CYP2R1为标准,比较了11个物种CYP2R1的二级结构;并以人CYP2R1结构为模板,对小鼠CYP2R1进行了同源建模,比较了小鼠CYP2R1与人CYP2R1三级结构的差异.(2)利用融合有His标签的pcDNA3.1(+)构建了小鼠CYP2R1真核表达载体pcDNA3.1-CYP2R1,该载体能有效提高CYP2R1的mRNA和蛋白表达水平,其中mRNA水平提高了82524.59倍.(3)小鼠CYP2R1能够同时上调细胞周期调控因子CyclinD1,P27和P21基因的表达,其中重组质粒转染组的CyclinD1和P27的相对表达量相比空载质粒转染组具有极显著差异(p0.01).推测CYP2R1参与了CyclinD1和P27对细胞周期的调控,但可能形成反馈调节系统CyclinD1-CDK-P27,导致Hela细胞的增殖变化不明显.

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    研究背景维生素D(Vitamine D,VD)是皮肤经紫外线照射后产生的一种类固醇激素。它除了在维持骨骼健康、调节钙磷平衡方面发挥重要作用外,研究表明:维生素D受体还存在于子宫、卵巢、睾丸等生殖器官,在子宫内膜及卵泡的生长发育、精子质量优劣方面发挥重要的生物学效应。维生素D代谢通路基因CYP2R1、CYP27B1、CYP24A1、GC和维生素D受体(Vitamine D Receptor,VDR)的异常表达可能影响维生素D水平,从而影响生殖功能的发挥。1978世在英国诞生,此后辅助生殖技术(Assisted Reproduction Technique,ART)发展迅猛。随着不孕症发病率的逐年增加,辅助生殖技术越来越被大众熟知和接受,但其临床妊娠率遭遇瓶颈,徘徊在50%。在许多研究中已经报道了维生素D对临床妊娠率和活产率的影响,但是研究结果并不一致,存在很大争议。维生素D在不孕人群的分布及影响因素缺乏大数据研究,同时维生素D在ART过程中是否有明确作用仍然难以捉合并其他影响代谢的内分泌疾病(如甲状腺疾病、高催乳素血症等);(3)子宫内膜异位症;(4)近半年内补充维者,测定卵泡颗粒细胞中维生素D代谢通路相关基因m RNA表达。(2)分组情况:(1)根据血清25(OH)D水平,分成VD充足组(14例):25(OH)D≥75 nmol/L、VD不足组(23例):50 nmol/L<25(OH)D<75 nmol/L、VD缺乏组(32例):25(OH)D≤50 nmol/L。(2)根据多囊卵巢综合征(Polycystic Ovarian Syndrome,PCOS)疾病诊断标准分成PCOS组和非PCOS(non-PCOS);根据胰岛素抵抗(Insulin Resistence,IR)的诊断标准,将PCOS分成:PCOS+IR组(23例)和PCOS+non-IR组(13例);将非PCOS组分成:非PCOS合并胰岛素抵抗组(简写non-PCOS+IR)(11例)和非PCOS未合并胰岛素抵抗简写(non-PCOS+non-IR组)(22例)。其中设定non-PCOS+non-IR组为对照组。2.研究方法(1)测定日血清25(OH)D水平;检测卵泡颗粒细胞中维生素D代谢通路基因CYP2R1

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