Screen Quest 免洗cAMP检测试剂盒*荧光能量共振转移法*

简要概述

Screen Quest 免洗cAMP检测试剂盒提供了一种便捷的分析方法，用于检测G蛋白偶联受体系统中腺苷酸环化酶的活化。与其他商用ELISA cAMP分析试剂盒相比，这种均质的cAMP分析试剂盒不需要洗涤步骤或乙酰化步骤。该测定基于荧光cAMP示踪剂和未标记的游离cAMP之间固定数目的抗cAMP抗体结合位点的竞争。游离cAMP从HRP-cAMP /抗cAMP抗体复合物中取代了荧光cAMP示踪剂。抗cAMP抗体用我们的TR Fluor Eu标记，而cAMP示踪剂包含我们的trFluor 650。在没有cAMP的情况下，trFluor 650-cAMP缀合物仅与TR Fluor Eu标记的抗cAMP抗体结合。但是，测试样品中未标记的游离cAMP竞争TR Fluor Eu标记的抗cAMP抗体偶联物，因此抑制了trFluor 650-cAMP与抗cAMP抗体的结合。 trFluor 650标记的cAMP示踪剂仅具有纳秒级的荧光寿命，而TR Fluor Eu标记的抗cAMP抗体结合的荧光cAMP示踪剂由于TR-FRET而具有更长的荧光寿命值。 FRET的大小与样品中cAMP的浓度成正比。该测定可以使用96孔或384孔微孔板进行。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Screen Quest 免洗cAMP检测试剂盒。

产品说明书

样品实验方案

溶液配制

储备溶液配制

cAMP标准（1mM）：将100 µL稀释剂（组分E）添加到cAMP标准品（组分C）中，并充分混合。 注意：未使用的cAMP标准液可以等分并保存在-20℃下。

工作溶液配制

1. Anti cAMP-trFluor Eu工作溶液：将55 µL（#36379）或550 µL（#36380或＃36381）稀释剂（组分E）添加到Anti cAMP-trFluor Eu（组分A）小瓶中。 将50 µL重构溶液添加到2.5 mL细胞裂解缓冲液（组分D）中。 

2. cAMP-trFluor 650工作溶液：在cAMP-trFluor 650小瓶（组分B）中加入55 µL（#36379）或550 µL（#36380或＃36381）稀释剂（组分E）。 将50 µL重构溶液添加到2.5 mL细胞裂解缓冲液（组分D）中。 

实验步骤

1.细胞制备：

1.1对于贴壁细胞：将细胞在生长培养基中以30,000-100,000个细胞/孔在96孔板中过夜培养。

1.2对于非贴壁细胞：从培养基中离心细胞，然后将细胞沉淀以100,000-300,000个细胞/孔的速率悬浮在培养基中，在96孔板中培养。 实验前，将板以800 rpm的速度离心2分钟。

1.3根据需要处理细胞：以下是用Forskolin处理的Hela细胞在96孔板中诱导cAMP的示例。 在生长培养基中添加25 µL细胞，在Hanks中加入25 µL /孔的100 µM Forskolin和20 mM Hepes缓冲液（HHBS），在5％CO₂、37℃恒温箱中孵育15分钟。 注意：应单独评估每个细胞系，以确定细胞密度。 细胞可以在实验的前一天或实验当天接种，具体取决于细胞类型和/或受试化合物的作用。

表1.黑色96孔板中cAMP标准品和测试样品的布局。 CS = cAMP标准（CS1-CS7）; BL =空白对照； TS =测试样品。

表2.每个孔的试剂组成。

2.细胞裂解物中的cAMP测定

2.1根据表1和表2提供的布局，准备并添加cAMP标准品（CS），空白对照（BL）和测试样品（TS）。对于384孔板，使用12.5 µL的每种相应试剂代替25 µL 。注意：测试样品可以是非刺激或刺激的样品。

2.2在cAMP标准品，空白对照和测试样品的每个孔中加入25 µL处理液（化合物重悬于缓冲液中），以使总cAMP测定体积为50 µL /孔。对于384孔板，将12.5 µL工作溶液添加到每个孔中，总体积为25 µL /孔。

2.3将反应在室温下孵育30分钟。

2.4将25 µL cAMP-trFluor 650工作溶液添加到cAMP标准品，空白对照和测试样品的每个孔中，使总cAMP测定体积为75 µL /孔。对于384孔板，将12.5 µL工作溶液添加到每个孔中，总体积为37.5 µL /孔。注意：对于阴性对照，可以添加裂解缓冲液。

2.5将25 µL cAMP-trFluor Eu工作溶液添加到cAMP标准品，空白对照和测试样品的每个孔中，使总cAMP测定体积为100 µL /孔。对于384孔板，在每个孔中加入12.5 µL工作溶液，总体积为50 µL。

2.6将反应在室温下孵育30分钟。

2.7在兼容的TR-FRET（时间分辨荧光分析仪）上检测。

表3.方案总结

表4.兼容的仪器汇总

参考文献

A cardiac mitochondrial cAMP signaling pathway regulates calcium accumulation, permeability transition and cell death
Authors: Wang Z, Liu D, Varin A, Nicolas V, Courilleau D, Mateo P, Caubere C, Rouet P, Gomez AM, V and ecasteele G, Fischmeister R, Brenner C.
Journal: Cell Death Dis (2016): e2198

Activation of P2X7 and P2Y11 purinergic receptors inhibits migration and normalizes tumor-derived endothelial cells via cAMP signaling
Authors: Avanzato, D and Genova, T and Pla, A Fiorio and Bernardini, M and Bianco, S and Bussolati, B and Mancardi, D and Giraudo, E and Maione, F and Cassoni, P and others
Journal: Scientific Reports (2016)

Changes in the Arabidopsis thaliana Proteome Implicate cAMP in Biotic and Abiotic Stress Responses and Changes in Energy Metabolism
Authors: Alqurashi M, Gehring C, Marondedze C.
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