Screen Quest cAMP检测试剂盒*荧光ELISA法*

简要概述

Screen Quest 荧光ELISA cAMP分析试剂盒提供了一种优化的分析方法，用于检测G蛋白偶联受体系统中腺苷酸环化酶的激活。该测定基于HRP标记的cAMP与未标记的cAMP之间固定数目的抗体结合位点的竞争。通过未标记的游离cAMP将HRP-cAMP从HRP-cAMP /抗cAMP抗体复合物中置换出来。在不存在cAMP的情况下，HRP-cAMP偶联物仅与抗cAMP抗体结合。然而，测试样品中未标记的游离cAMP与HRP-cAMP抗体偶联物竞争抗cAMP抗体，因此抑制了HRP-cAMP与抗cAMP抗体的结合。我们的Screen Quest 荧光cAMP分析试剂盒提供了检测腺苷酸环化酶活性的灵敏方法。与其他商用ELISA cAMP分析试剂盒相比，它消除了繁琐的乙酰化步骤。该试剂盒使用Amplite Red作为荧光HRP底物来定量HRP活性。形成的荧光产物与HRP-cAMP偶联物的活性成比例。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Screen Quest cAMP检测试剂盒。

产品说明书

样品实验方案

简要概述

1. 准备样品

2. 将75 µL /孔的cAMP标准品或测试样品添加到抗cAMP的96孔板中

3. 在室温下孵育5-10分钟

4. 加入25 µL /孔的1X HRP-cAMP偶联物

5. 在室温下孵育2小时

6. 用200 µL /孔的洗涤缓冲液洗涤4次

7. 添加100 µL /孔的Amplite Red

8. 在室温下孵育15至60分钟

9. 检测Ex / Em = 540/590 nm时的荧光增加

溶液配制

储备溶液配制

1. cAMP储备溶液（100 µM）：将1 mL测定缓冲液（组分B）添加到cAMP标准品（组分A）的小瓶中。 注意：应将未使用的cAMP储备溶液（100 µM）等分并保存在-20℃。

2. HRP-cAMP偶联物原液（50X）：将55 µL（#36373）或550 µL（#36374）的测定缓冲液（组分B）添加到HRP-cAMP偶联物（组分C）的小瓶中。 注意：未使用的50X HRP-cAMP偶联物原液应分为一次性使用的等分试样，并在-20℃保存。

3.洗涤液（1倍）：将1 mL的10X洗涤溶液（组分D）添加到9 mL蒸馏水中。

4. Amplite Red储备液（200X）：将50 µL（#36373）或500 µL（#36374）的DMSO加入到Amplite Red（组分G）的小瓶中。 注意：0.5 µL 200X Amplite Red储备液足以用于一个测定点。 应将未使用的再生原液分装并储存在-20℃。

工作溶液配制

1. HRP-cAMP工作溶液：在使用前，用测定缓冲液（组分B）以1:50稀释，使其具有1X HRP-cAMP偶联物工作溶液。 存放在冰箱或4°C。 注意：25 µL 1X HRP-cAMP偶联物工作溶液足以用于一个测定点； 准备适当的体积，仅供一次性使用。

2. Amplite Red工作溶液：向10 mL底物缓冲液（组分I）中加入50 µL Amplite Red储备溶液（200X）和11.5 µL 3％H₂O₂（组分F）注意：Amplite Red工作溶液不稳定，请立即使用。

实验步骤

1.准备样品

1.1根据需要处理细胞：
以下是用Forskolin处理的Hela细胞以96孔板诱导cAMP的示例：吸出细胞生长培养基，在Hanks中加入100 µL /孔100μM Forskolin和20 mM Hepes缓冲液（HHBS），在5％CO₂，37°C恒温箱，放置15分钟。孵育后吸出细胞溶液，加入100 µL /孔的细胞裂解缓冲液（组分E），然后在室温下另外孵育10分钟。该细胞裂解液可以直接测定，也可以在测定缓冲液（组分B）中稀释后测定。注意：应单独评估每个细胞系，以确定细胞密度。细胞可以在实验的前一天或实验当天接种，具体取决于细胞类型和/或受试化合物的作用。

1.2组织样本：
由于组织中环状核苷酸的快速代谢，重要的是在收集后快速冷冻组织（例如，使用液氮）。称重冷冻的组织，并添加10-20 µL / mg细胞裂解缓冲液。在冰箱均质样品。高速旋转5分钟并收集上清液。上清液可以直接测定。

1.3尿液，血浆和培养基样品：
尿液和血浆可以直接在1X裂解缓冲液中以1：200至1：1000的稀释度进行测试。也可以在裂解缓冲液中以1:10至1：200的稀释度测试培养基。注意：RPMI介质可能包含> 350 fmol / µL cAMP。

2.cAMP测定

2.1所有测定孔均按以下顺序准备：A）cAMP标准品，对照或测试样品； B）HRP-cAMP偶联物。

2.2将75 µL /孔的cAMP稀释标准溶液和测试样品添加到抗cAMP Ab包被的96孔板（组分F）的每个孔中。 我们建议对每个标准品和测试样品重复测定。在室温下孵育5至10分钟。

2.3加入25 µL /孔的1X HRP-cAMP偶联物工作溶液。 将板放在摇床上，在室温下孵育2小时。

2.4吸出板内容物，并用200 µL /孔的1X洗涤液洗涤4次。

2.5在每个孔中加入100 µL /孔的Amplite Red工作溶液，并在避光的条件下在室温下孵育10分钟至2小时。

2.6通过使用荧光酶标仪（顶部读取模式），检测Ex / Em = 540/590 nm（截止570 nm）处的荧光增加。

图示

图1.使用Screen Quest 荧光ELISA cAMP测定试剂盒在带有Gemini酶标仪的黑色96孔板上测量cAMP剂量反应。