Amplite 荧光法通用型蛋白激酶检测试剂盒 红色荧光

简要概述

Amplite 荧光法通用型蛋白激酶检测试剂盒是美国AAT Bioquest生产的用于检测蛋白激酶的试剂盒，。本试剂盒提供了一种快速、简单、均一的激酶活性检测法。它具有高灵敏度(<0·2 uM ADP)、宽ATP耐受性(1-300 uM)，不基于抗体，无发射性和不需洗脱就可以对酶催化产生的总ADP进行检测，这些特性使它成为检测激酶米氏方程动力学，筛选和鉴定激酶抑制剂的一种理想试剂盒。本检测法可以便捷地用于96或384微孔板分析，并且无需任何分步操作就可以轻易地实现自动化。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Amplite 荧光法通用型蛋白激酶检测试剂盒。 

产品说明书

样品实验方案

简要概述

运行激酶反应（20μL）
添加ADP传感器缓冲液（20μL）
添加ADP传感器工作溶液（10μL）
在室温下孵育15分钟--1小时
监测Ex / Em = 540/590 nm处的荧光强度（截止= 570nm）

溶液配制

1.储备溶液配制

除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。 避免反复冻融循环。
1. 1ADP Sensor I储备溶液（50X）：
将50μLDMSO（组分B3）加入到ADP传感器1（组分B1）的小瓶中，制备50X ADP传感器I储备溶液。

1.2ADP标准溶液（300 mM）：
向ADP标准品（组分C）中加入100μLDdH2O，制成300mM ADP标准溶液。

2.标准溶液配制

ADP标准配制
取300 mM ADP标准溶液，在激酶反应缓冲液中稀释10,000倍，制成30μMADP标准溶液。 取30μMADP标准溶液，在激酶反应缓冲液中进行1：3连续稀释，得到ADP标准溶液的连续稀释液。 注意：通过包含不含ADP的样品来测量背景荧光，在激酶反应缓冲液中连续稀释ADP标准品。

3.工作溶液配制

将50μL50XADP Sensor I储备溶液加入到ADP Sensor II（组件B2）的样品瓶中，制成ADP Sensor工作溶液。 注意：重组的ADP不稳定，可根据需要制作新鲜溶液，随用随配。

操作步骤

1.运行激酶反应（此步骤不提供试剂）：

1.1根据需要制备20μL（或对于384孔板10μL）激酶反应溶液/孔。 应根据需要优化激酶反应的组分（例如，特定激酶反应可能需要优化的缓冲系统）。 在大多数情况下，如果您没有优化的激酶缓冲液，ADP检测缓冲液（组分D）也可用于运行激酶反应。

1.2Amplite 荧光激酶检测试剂盒用于确定ADP的形成。

2.运行Amplite ADP分析：

2.1将20μLADP缓冲液（组分A）和10μLADP工作溶液加入每个充满20μL激酶反应溶液的孔中，使总ADP测定体积为50μL/孔。 对于384孔板，在每个充满10μL激酶反应溶液的孔中加入10μLADP传感器缓冲液（组分A）和5μLADP，使总ADP测定体积为25μL/孔。

2.2将反应混合物在室温下孵育15分钟至1小时。

2.3用Ex / Em = 540 / 590nm（截止值= 570nm）的荧光板读数器监测荧光强度。

3.生成ADP校准曲线（筛选激酶抑制剂不需要）：

3.1添加20μL（对于96孔板）或10μL（对于384孔板）/孔ADP传感器缓冲液（组分A）和10μL（对于96孔板）或5μL（对于384） （间隔板）ADP传感器进入连续稀释的ADP标准品的每个孔中，使每个反应的总体积为50μL（对于96孔板）或25μL（对于384孔板）。

3.2将反应混合物在室温下孵育15分钟至1小时。

3.3用Ex / Em = 540 / 590nm（截止值= 570nm）的荧光板读数器监测荧光强度。

3.4生成ADP标准曲线。

数据分析

        从空白标准孔获得的读数（RFU）用作阴性对照。 从其他标准的读数中减去该值，以获得基线校正值。 然后，绘制标准读数以获得标准曲线和方程。 该等式可用于计算ADP剂量样本。