Cell Meter™荧光细胞间隙连接检测试剂盒

简要概述

间隙连接是由连接蛋白构成的专门的细胞间膜通道，可选择性促进<1.5 kD的小分子通过细胞。它们受电压，生长因子，cAMP和类维生素A的紧密调节，。Cell Meter™荧光细胞间隙连接检测试剂盒为体外测定间隙连接功能提供了可靠而强大的检测方法。该方法是非侵入性的。对研究中的细胞群进行划分，以使其中一小部分载有亲脂性细胞质膜可渗透染料Calcein UltraGreen™AM，当细胞质酯酶吸收细胞时，该染料会水解，从而生成Calcein UltraGreen（一种高度荧光且保留良好的膜） -不可渗透的分子。另一部分是DiD，它是一种亲脂性膜染料，在掺入膜时会横向扩散，使整个细胞膜染成深红色荧光。将两个部分混合并在共培养条件下孵育。钙黄绿素UltraGreen通过间隙连接转移到DiD染色的细胞中。 终可以通过荧光成像或流式细胞术检测。

产品说明书

样品分析方案

概述

将钙黄绿素Ultragreen AM工作溶液添加到细胞中

将DiD工作溶液添加到细胞中

在37°C下孵育10-30分钟

用GAP连接检测缓冲液洗涤细胞

将细胞重悬于细胞培养基中并按1：1比例混合

使用带有530/30 nm和660/20 nm发射滤光片的流式细胞仪或带有FITC和Cy5滤光片组的荧光 在不同时间检测荧光信号 

储备溶液配制

1. Calcein Ultragreen AM储备溶液
将50 µL DMSO（组分D）加入一个Calcein Ultragreen AM样品瓶（组分A）中，并充分混合。
注意：将未使用的Calcein Ultragreen AM储备溶液分装在-20°C下，一次性使用，以免冻融循环。
注意：一个样品瓶足以进行50次测试。

2. DiD储备溶液
将100 µL DMSO（组分D）加入DiD（组分B）中并充分混合。
注意：将未使用的DiD储备溶液分装在-20°C下，以单次使用，以免冻融循环。
 
工作溶液配制
1. Calcein Ultragreen AM工作溶液
将1 µL钙黄绿素超绿AM储备溶液添加到1 mL的GAP连接分析缓冲液中并充分混合。
注意：不宜储存Calcein Ultragreen AM工作溶液，应立即使用。
注意：1 mL Calcein Ultragreen AM工作溶液足以进行两次测试。

2. DiD工作溶液
将1 µL DiD储备溶液加到1 mL GAP连接分析缓冲液中并充分混合。
注意：DiD工作溶液不宜存储，应立即使用。
注意：1 mL DiD工作溶液足以进行两次测试。

操作步骤

以下协议可用作指导，应根据需要进行优化。
钙黄绿素超绿AM的细胞染色

1. 在6孔细胞培养板的细胞培养基中培养细胞。

2. 除去细胞培养基，并加入0.5 mL钙黄绿素Ultragreen AM工作溶液。

3. 在37°C下孵育细胞10-20分钟。
   注意：应为每个细胞系优化孵育时间。

4. 除去染料工作溶液，并用GAP连接分析缓冲液洗涤细胞。
   注意：对于贴壁细胞，请使用细胞橡胶刮板将细胞从板上分离下来。

5. 在细胞培养基中重悬细胞。 

DiD的细胞标记

1. 在6孔细胞培养板的细胞培养基中培养细胞。

2. 除去细胞培养基，并加入0.5 mL DiD工作溶液。

3. 在37°C下孵育细胞10-20分钟。
   注意：应为每个细胞系优化孵育时间。

4. 除去染料工作溶液，并用GAP连接分析缓冲液洗涤细胞。
   注意：对于贴壁细胞，请使用细胞橡胶刮板将细胞从板上分离下来。

5. 在细胞培养基中重悬细胞。 

GAP连接测定

1. 将钙黄绿素染色的细胞和DiD标记的细胞以1：1的比例混合，并铺在孔中。
   注意：对于荧光 ，将每个50 µL加到96孔板的孔中并混合均匀。
   注意：对于流式细胞仪，将每一种加入500 µL到6孔板的孔中并混合均匀。

2. 在37°C下孵育细胞2-3小时。

3. 使用FITC和Cy5滤光片组通过荧光 检测细胞。

4. 对于流式细胞仪分析：对于贴壁细胞，使用细胞橡胶刮板分离细胞。一旦细胞处于悬浮状态或对于悬浮细胞，请用DPBS或您选择的缓冲液洗涤细胞两次。将细胞重悬于HHBS（#20011）或DPBS或您选择的缓冲液中，并使用530/30 nm滤光片（FITC通道）和660/20 nm滤光片（APC通道）检测。 

图示

图1.通过流式细胞仪分析了GAP连接。根据方案，分别用钙黄绿素超绿AM和DiD对HeLa细胞进行染色。将细胞以1：1的比例充分混合，并用细胞培养基重新铺片。使用带有FITC和APC通道的NovoCyte流式细胞仪（ACEA Biosciences）检测反应。随着时间的推移，Q2-2（双阳性）增加。