Cell Meter 细胞活性检测试剂盒（活细胞/死细胞） *绿色/红色双重荧光*

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简要概述

        Cell Meter 细胞活性检测试剂盒是美国AAT Bioquest生产的细胞活性检测试剂盒，Cell Meter检测试剂盒是一类用于检测细胞功能的系列工具，包括细胞活性、细胞毒性、细胞凋亡、细胞膜电位以及细胞周期等方面的指标。每种检测方案均能提供不同荧光颜色的检测方案。这些检测方案为从多角度研究细胞功能活动提供了一种十分有效的方法。Cell Meter细胞活力检测试剂盒 *绿色/红色双重荧光* 使用两种非荧光性指示剂：Calcein AM，用于活细胞；一种非细胞渗透性的DNA结合染料，用于细胞膜不完整的死细胞。Calcein AM是一种疏水性复合物，可以轻易地渗透进入完整的活细胞，通过酯酶的水解作用，产生强烈的荧光。通过细胞内酯酶水解非荧光性Calcein AM，形成具有强烈荧光的亲水性Calcein，并且保留在细胞质中。这种酯酶的活性与活细胞数量成比例关系。DNA结合染料极性非常大，不能渗透进入具有完整细胞膜的活细胞，它只有在与死细胞的DNA结合的情况下才发出荧光。生长在培养板中的细胞可以被染料，且在不到两小时内就可以完成定量分析。本检测法比其它活细胞检测法更加强大、稳定。它可以用于许多荧光实验平台的高通量分析中，例如微孔板分析，免疫组化和流式细胞术。本试剂盒提供所有必需组分和检测方案。它适合于增殖型和非增殖型细胞，也可用于悬浮和贴壁细胞。96微孔板中，每孔用试剂100ul，本试剂盒提供的试剂足以进行100次检测；384微孔板中，每孔加试剂25ul，本试剂盒提供的试剂足以进行400次检测。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Cell Meter 细胞活性检测试剂盒。 

样品实验方案

简要概述

1.用测试化合物制备细胞
2.加入相同体积的CytoCalcein Green / Propidium Iodide染料加工溶液（100μL/孔/ 96孔板或25μL/孔/ 384孔板）
3.在室温或37°C孵育1小时
4.在强度下监测荧光（底部读取模式）Ex / Em = 490 / 525nm（截止= 515nm）和540 / 620nm（截止= 590nm），带有FITC滤光片（细胞存活）的荧光显微镜和TRITC滤光片 （细胞死亡），或FL1和FL2通道的流式细胞仪。

溶液配制

1.储存溶液配制

        除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。 避免反复冻融循环。
CytoCalcein 绿色原液：
将20μLDMSO（组分C）加入到CytoCalcein Green（组分A）的小瓶中并充分混合以制备CytoCalcein Green原液。 避光。 注意：20μL的CytoCalcein Green原液足以用于一个平板。 存放时，密封管。

2.工作溶液配制

将全部内容物（20μL）的CytoCalcein Green储备溶液和20μL碘化丙啶（组分B）加入10mL测定缓冲液（组分C）中并充分混合以制备CytoCalcein Green /碘化丙锭染料 - 工作溶液。 CytoCalcein Green / Propidium Iodide染料加工溶液在室温下稳定至少2小时。 注意：如果CHO细胞等细胞含有导致荧光染料随时间泄漏的有机阴离子转运蛋白，应制备丙磺舒储备溶液，并加入到加样缓冲液中， 终孔内工作浓度范围为1到2.5 mM。 未使用的丙磺舒储备溶液可以在≤-20℃下储存。 由于染色条件可能因细胞类型的不同而异，因此建议单独确定组分A和B的适当浓度。有关细胞样品制备的指南，请点击查看。

操作步骤

1.用酶标仪或荧光显微镜进行细胞活力测定：

1.1根据需要用测试化合物处理细胞。注意：在添加化合物之前不必洗涤细胞。然而，如果测试的化合物对血清敏感，则可在添加化合物之前吸出生长培养基和血清因子。在抽吸后加入100μL/孔/ 96孔板和25μL/孔/ 384孔板的1X Hank盐溶液和20mM Hepes缓冲液（HHBS）或您选择的缓冲液。或者，细胞可以在无血清培养基中生长。

1.2加入100μL/孔（96孔板）或25μL/孔（384孔板）的CytoCalcein TM Green / Propidium Iodide染料加工溶液。

1.3将板在室温或37°C孵育30分钟至1小时，避光。 （孵育时间可以从15分钟到过夜。我们得到了结果，孵育时间少于4小时）。注意：适当的孵育时间取决于所使用的单个细胞类型和细胞浓度。优化每个实验的孵育时间。装载后请勿清洗细胞。对于非粘附细胞，建议在孵育后以800rpm离心细胞板2分钟，然后关闭制动器。

1.4使用荧光酶标仪（底部读取模式）在Ex / Em = 490 / 525nm（截止= 515nm）和Ex / Em = 540 / 620nm（截止= 590nm，细胞死亡）或荧光下监测荧光强度用于活细胞的FITC过滤器或用于死细胞的TRITC过滤器的显微镜。

2.使用流式细胞仪进行细胞活力测定：

2.1用测试化合物处理细胞一段所需的时间。

2.1离心细胞，得到1-5×10⁵个细胞/管。

2.3将细胞重悬于500μL的CytoCalcein™Green / Propidium Iodide染料加工溶液中。

2.4在室温或37°C孵育10至30分钟，避光。

可选：用HHBS或您选择的缓冲液清洗细胞。 将细胞重悬于500μLHHBS中，每管加入1-5×10⁵个细胞。

2.5用流式细胞仪在Ex / Em = 490 / 525nm和Ex / Em = 490 / 620nm（FL1和FL2通道）下监测荧光强度。

数据分析