Amplite 过氧化物和过氧化酶近红外荧光底物

简要概述

        Amplite 过氧化物和过氧化酶近红外荧光底物是美国AAT Bioquest生产的用于检测过氧化氢的荧光探针，我们的Amplite IR是一种荧光性过氧化酶底物，与过氧化酶和H₂O₂反应时，产生近红外荧光。它可以用来检测H₂O₂和过氧化酶。Amplite IR产生的物质在647nm处具有最大吸收峰，同时在647nm处有最大发射峰。这种近红外吸收和荧光将检测的本底降至最小，这些本底经常由自我吸收和/或生物样品自身的荧光，但是在600nm附近自身光吸收基本没有。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Amplite 过氧化物和过氧化酶近红外荧光底物。 

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产品说明书

样品实验方案

简要概述

1.制备100μMAmplite IR 0.8 U / ml的过氧化物酶在磷酸盐缓冲液，并在孔中加入50微升

2.添加H ₂ O ₂标准品或测试样品（50μL）

3.在室温下孵育0-30分钟

4.监测Ex / Em = 640 / 680nm处的荧光强度

溶液制备

1.储备溶液

所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。避免反复冻融循环。
1.1Amplite IR原液：
加入适量无水DMSO，制成10至25 mM Amplite IR原液。

2.工作溶液

Amplite IR工作溶液（2X）：
为了在50 mM磷酸盐缓冲液或您选择的缓冲液中达到每孔50至100μM的最终浓度，在管中制备100至200μM浓度的溶液。每孔需要50μL。 注意：在硫醇如DTT和b-巯基乙醇存在下，Amplite IR不稳定。高于10μM（最终浓度）的硫醇可显着降低测定动态范围。NADH和谷胱甘肽（从GSH中还原）可能会干扰测定。注意：我们建议您每次进行实验时都使用新鲜原液。

操作步骤

1.在上清液中进行H₂O₂测定

1.1将50μL的2X Amplite IR工作溶液（来自步骤1.2）添加到H ₂ O ₂标准品，空白对照和测试样品的每个孔中，以使总H₂O₂测定体积为100μL/孔。注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μL2XAmplite IR工作溶液。

1.2在室温下孵育反应0至30分钟，避光。

1.3使用荧光板读数器监测Ex / Em = 640 / 680nm处的荧光增加。 注意：Amplite IR过氧化物酶底物易于自氧化，因此一旦加入H₂O₂反应混合物就读取荧光，以提高信噪比。

1.4空白孔中的荧光（仅使用测定缓冲液）用作对照，并从具有H₂O_2的那些孔的值中减去。

2.运行H₂O₂测定法的细胞：

2.1Amplite IR可用于测量细胞中H₂O₂的释放。以下是建议的方案，可根据您的具体研究需要进行修改.Dipite IR工作溶液应按步骤1.2制备，但磷酸盐缓冲液应替换为细胞培养系统中使用的培养基。建议的培养基包括（a）Krebs Ringers磷酸盐缓冲液（KRPB）; （b）中。汉克斯平衡盐溶液（HBSS）; 或（c）无血清培养基。

2.2在96孔板（50-100μL/孔）中制备细胞，并根据需要激活细胞。 注意：包括阴性对照（单独培养基和非活化细胞）用于测量背景荧光。

2.3加入50微升H₂O₂反应混合物至细胞的每个孔中，注意：对于384孔板中，添加25μL细胞和25微升H₂O₂反应混合物倒入每个孔。

2.4在室温下孵育反应0至30分钟，避光。

2.5使用荧光板读数器监测Ex / Em = 640 / 680nm处的荧光增加。 注意：也可以将板的内容物转移到白色透明底板上，并用吸光度酶标仪在670nm波长下读数。与荧光读数相比，吸收检测具有较低的灵敏度。 注意：荧光背景随时间增加，因此减去每个数据点的空白孔的荧光强度值是很重要的。