钙离子荧光探针Cal-520, AM

产品参数

简要概述

        钙离子荧光探针Cal-520 , AM是美国AAT Bioquest生产的钙离子荧光探针，Calbryte 520，Calbryte 590和Calbryte 630提供 强大的均匀荧光测定工具，用于检测细胞内钙动员。与现有的钙指示剂（如Fluo-3 AM，Fluo-4 AM和Rhod-2 AM）相比，这些钙敏感染料明显更亮，并提供更高的信噪比，大大提高了细胞内保留和负载效率。表达通过钙发出信号的GPCR或钙通道的细胞可以预装载可以穿过细胞膜的Calbryte 520 AM，Calbryte 590 AM或Calbryte 630 AM。一旦进入细胞内，Cal520 AM，Calbryte 590 AM或Calbryte 630 AM的亲脂性阻断AM基团被细胞内酯酶切割，产生带负电荷的荧光Calbryte 染料，留在细胞内。它们与钙结合后的荧光大大增强。当用激动剂刺激细胞时，该受体表示细胞内钙的释放，这显着增加了Calbryte 520，Calbryte 590或Calbryte 630的荧光。高灵敏度和> 100倍荧光增强的特性使Calbryte 520 AM， Calbryte 590 AM或Calbryte 630 AM是测量细胞内钙的 强大指标。

        除了方便的激发波长和钙的大荧光增强外，Calbryte 520，Calbryte 590和Calbryte 630主要定位于细胞溶胶中，不像Rhod-2主要位于线粒体中。 此外，Calbryte 590和Calbryte 630的长Ex / Em波长使这些染料成为钙指示剂，可与绿色荧光蛋白（GFP）细胞系进行多色检测。 此外，Calbryte 520，Calbryte 590或Calbryte 630钙测定经过优化，可与大多数现有荧光仪器兼容。 Calbryte 520可在488 nm处激发，并与FITC滤光片组配合使用。 Calbryte 590经过优化，可在555 nm激发，并与TRITC / Cy3滤光片组配合使用。 Calbryte 630经过优化，可在594 nm激发，并与TexasRed®滤光片组配合使用。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的钙离子荧光探针。

实验方案

将Cal-520®，AM加载到活细胞中的方案

操作步骤

1.准备HHBS缓冲液，10％Pluronic®F-127溶液和25 mM 丙磺舒溶液

2.在高质量无水DMSO中制备2 mM至5 mM Cal-520®，AM原液
a.Cal-520®，AM的用量：1毫克
b.所需浓度：2 mM
c.在合适的容器中，将1mg的Cal-520，AM与453.33μL的无水DMSO混合。

3.使用10μMCal-520®，AM 4在HHBS中制备2X工作溶液，0.08％Pluronic®F-127和2 mM丙磺舒。
a. 终孔内浓度为Cal-520®，AM：5μM
b.Pluronic®F-127的 终井内浓度：0.04％
c. 终孔内浓度的丙磺舒：1mM
d.在合适的容器中混合16μL的Cal-520，AM，25.6μL的10％Pluronic F-127和256μL的25mM丙磺舒。然后，添加HHBS或您选择的缓冲液，直到体积为3.2 mL。

注意：对于大多数细胞系，我们建议使用Cal-520®的 终浓度，AM为4至5μM。
注意：推荐的Pluronic F-127井浓度 终为0.02％至0.04％。
注意：推荐的 终浓度为1至2.5 mM的丙磺舒。

4.将100μL染料工作溶液加入已经含有100μL培养基的所需孔中。
a.该步骤将染料工作溶液从2X稀释至1X，并将每种组分的 终浓度调节至：5μMCal-520®，AM，0.04％Pluronic®F-127,1mM丙磺舒。

5.孵育
a.将添加染料的培养基在细胞培养箱中孵育60-90分钟。
b.将添加染料的培养基在室温下孵育30分钟。

6.用1.0 mM 丙磺舒，准备HHBS缓冲液（或您选择的缓冲液）
a.在合适的容器中加入160μL的25mM丙磺舒。 接下来，添加HHBS或您选择的缓冲液，直到体积为4 mL

7.用HHBS缓冲液或您选择的缓冲液替换染料工作溶液，使用1.0 mM 丙磺舒。
a.首先，从所需孔中除去200μL染料工作溶液和培养基。
b.在相同的孔中加入200μL含有1.0mM丙磺舒的HHBS（或您选择的缓冲液）。

8.实验观察
a.为您的样品添加所需的处理。
b.在Ex / Em = 492/514 nm进行观察。

附加信息

1 M NaOH配方：
1.在合适的容器中准备2 mL蒸馏水。
2.在混合下向溶液中缓慢加入100mg NaOH。
3.加入蒸馏水至体积为2.5 mL。
4.在室温下将溶液储存在塑料容器中。

注意：步骤2这是一个放热过程，应遵循适当的预防措施和指南。

10％Pluronic F-127配方：
1.将1克Pluronic®F-127（Cat#20050）溶解在10毫升蒸馏水中，制成10％（w / v）储备溶液。
2.在40至50℃的温度下加热10％Pluronic F-127储备溶液约30分钟。
3.根据其储存规格储存多余的10％Pluronic®F-127。

25 mM Probenecid配方：
1.在合适的容器中，将1小瓶（72mg）的丙磺舒（Cat＃20060）溶解在0.3mL的1M NaOH中。
2.加入HHBS或您选择的缓冲液，直至体积为10 mL。
3.根据其储存规格分装并储存任何未使用的25 mM 丙磺舒溶液。

重点提示：
1.可根据实验设置的需要和体积调整浓度。
2.Pluronic®F-127（PF-127）是一种非离子表面活性剂，对细胞无毒。 PF-127通常与染料一起使用AM酯改善其水溶性。
3.如果您的细胞含有有机体阴离子转运蛋白，可将丙磺舒（0.5-1.0 mM）添加到染料工作溶液中减少脱酯化指标的泄漏。
4.细胞加载所需指示剂的确切浓度必须根据经验确定。
5.如果孵育> 2小时，染料在一些细胞系上表现更好。

参考文献

In Neurobiology, Cal-520® AM has been used to study:
» Neuron single action potentials in neocortical neurons both in vitro and in vivo, and associated voltage-dependent calcium channels[1]
» Superior colliculus in mice in conjunction with two-photon calcium imaging to visualize retinal ganglion cells in the superficial lamina[2]
» Aldolase C compartments in mice, looking at complex spike synchrony and its relation to sensory processing in awake animals[3]
» Neural circuits in brain slice and whole brain preparation, specifically looking at individual action potentials in vivo[4]
» Ca2+ dependent cell signaling pathways using cultured human neuroblastoma SH-SY5Y cells and high-speed video-microscopy[5]

In Cell Signaling, Cal-520® AM has been used to study:
» Intracellular calcium in sperm using the microplate reader platform as a means to quantitating parameters such as motility[6]
» Calcium signaling pathways in meniscus fibrochondrocytes by way of visualizing calcium localization and concentration[7]
» Ca2+ mediated cellular signaling in relation to inositol triphosphate and its flux through gap junctions[8]
» Retinal wave-mediated formation of calcium transients in Müller glial cells with focus on expression of GCaMP3[9]
» Ca2+ signaling pathways in zebrafish sperm, specifically looking at calcium flux resulting from cGMP-induced hyperpolarization[10]

In Cardiology, Cal-520® AM has been used to study:
» Sarcoplasmic reticulum insofar as its role in cardiac excitation-contraction coupling and calcium spark events[11]
» Optical mapping of calcium in cardiac tissue slices to develop a framework for future investigations into calcium transients[12]
» Sodium-calcium exchanger functionality and mechanism with regards to burst pacemaker activity in knockout mice[13]
» Pacemaker modulation in embryonic heart as a function of inositol-1,4,5-triphosphate receptors[14]
» Calcium current and the role of potassium channel-interacting protein 2 (KChIP2) in mice with regards to heart failure[15]