Amplite 荧光法谷胱甘肽GSH/GSSG比率快速检测试剂盒 绿色荧光

适用范围

用于检测谷胱甘肽

产品介绍

当细胞暴露于升高的氧化应激水平时，氧化型谷胱甘肽（GSSG）会积累，导致GSH/GSSG比值下降。谷胱甘肽还原酶通过同时氧化β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），将GSSG循环还原为GSH。监测GSH/GSSG比值并定量生物样本中的GSSG，对于评估细胞和组织在谷胱甘肽抗氧化及自由基损伤保护作用下的氧化还原和解毒状态至关重要。目前市场上虽有多种生物体系硫醇定量试剂或检测试剂盒，但商业试剂盒普遍存在灵敏度不足或操作流程繁琐的问题。

Amplite®快速荧光法GSH/GSSG比值检测试剂盒（货号#10060）提供了一种超灵敏的GSH定量方案。该试剂盒采用专用水溶性非荧光染料，其与硫醇反应后可产生强荧光信号，通过一步荧光法即可在100 µL检测体系中灵敏检测低至1pmol的半胱氨酸或GSH。本检测体系兼容96孔板或384孔板微孔板格式，无需分离步骤即可轻松实现自动化操作，使用荧光酶标仪即可便捷读取信号。

适用仪器

注：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品实验方案

96孔板测定示例（100个测试）

概述

1.准备Thiolite 绿色反应混合物（50μL）

2.添加GSH标准品和/或GSSG标准品或测试样品（50μL）

3.在室温下孵育10至60分钟监测Ex / Em = 490/520 nm处的荧光增加

注意：在开始实验之前，在室温下解冻所有试剂盒组分。

操作方法

1.准备GSH标准储备液：

将200μL测定缓冲液（组分B）加入到GSH标准品（组分C）的小瓶中以制备1mM（1nmol / L）GSH标准储备溶液。

注意：未使用的GSH标准储备溶液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

2.准备GSSG标准库存解决方案：

将200μlddH2O加入到GSSG标准品（组分F）的小瓶中以制备1mM（1nmol / L）GSSG标准储备溶液。

注意：未使用的GSSG标准储备溶液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

3.准备100X Thiolite Green原液：

将100μLDMSO（组分D）加入小瓶硫醇石绿（组分A）中以制备100X Thiolite™Green原液。

注意：未使用的Thiolite™Green原液应分成单次使用的等分试样，保存在-20℃，避免光照。

4.准备GSH分析混合物（GAM）：

将100μL100XThiolite™Green原液（来自步骤3）加入10mL测定缓冲液（组分B）中，并通过涡旋充分混合。

注1：该GSH测定混合物（GAM）足以用于两个96孔板。在室温下不稳定，应在2小时内及时使用，避免暴露在光线下。

注2：或者，可以通过按比例添加含有分析缓冲液的100X Thiolite™Green原液来制备GSH分析混合物。

5.准备总GSH分析混合物（TGAM）：

将5mL GAM（来自步骤4）加入GSSG探针（组分E）瓶中，并充分混合。

注1：该总GSH测定混合物（TGAM）足以用于一个96孔板。在室温下不稳定，应在2小时内及时使用，避免暴露在光线下。

注2：或者，可以通过向组分E的瓶中加入200μL的ddH2O制备25X GSSG探针，然后通过按比例混合储备溶液与GAM（来自步骤4）来制备TGAM测定混合物。将未使用的25X GSSG探针储备液等分并保存在-20℃，避免冻融循环。

6.准备连续稀释的GSH标准品（0至5μM）：

6.1将10μL的GSH标准储备溶液（来自步骤1）加入到990L的测定缓冲液（组分B）中以产生10M（10pmol / L）GSH标准溶液。

注意：稀释的GSH标准溶液不稳定。 在4小时内使用。

6.2取200μL10μMGSH标准溶液进行1：2连续稀释，得到5,2.5,1.25,0.625,0.3125,0.1563,0.0781和0μM连续稀释的GSH标准品。

6.3如说明书中表1和表2所示，将GSH标准品和含有GSH的测试样品加入到96孔微量培养板中。当仅需要GSH测定时，根据表1仅填充左侧两列（A组）中的孔。跳过第7步，直接进入第8步。

注意：根据需要处理细胞或组织样本。

7.准备连续稀释的GSSG标准品（0至5μM）：

7.1将10μLGSSG标准储备溶液（来自步骤2）加入990L测定缓冲液（组分B）中以产生10μM（10pmol / L）GSSG标准溶液。

注意：稀释的GSSG标准溶液不稳定。 在4小时内使用。

7.2取200μL10μMGSSG标准溶液进行1：2连续稀释，得到5,2.5,1.25,0.625,0.3125,0.1563,0.0781和0μM连续稀释的GSSG标准品。 总GSH标准溶液的浓度应为GSSG标准溶液浓度的两倍，分别为10,5,2.5,1.25,0.625,0.3125,0.1563和0μM。

7.3如说明书中表1和2所示，将GSSG标准品和含有GSH的测试样品加入到96孔微孔板中。当需要总GSH测定时，根据A组（左）和B组（右）填充孔。

注意：根据需要处理细胞或组织样本。

8.运行GSH和总GSH测定：

8.1将50μLGSHAssay Mixture（GAM，来自步骤4）加入GSH标准的A组（左），空白对照和测试样品（来自步骤6.3）的孔中，使总测定体积为100μL/孔。

注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μLGSHAssay混合液。

8.2如果需要总GSH（在还原和氧化状态下）测定，将50μL总GSH测定混合物（来自步骤5的TGAM）加入到GSSG标准，空白对照和测试样品的B组（右）的孔中（来自 步骤6.3）使总测定体积为100μL/孔。

注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μL总GSH分析混合物。

8.3在室温下孵育反应10分钟至1小时，避光。

8.4用荧光板读数器监测Ex / Em = 490 / 520nm处的荧光增加。