染色质免疫共沉淀实验介绍快讯

染色质免疫共沉淀（ChIP）是一种在活细胞状态下研究蛋白质与DNA相互作用的重要技术。

实验步骤：

细胞固定---细胞裂解---染色质超声破碎---免疫沉淀---洗涤---洗脱---反交联---DNA纯化回收

1、细胞固定：用甲醛处理细胞，使蛋白质与DNA交联，固定它们的相互作用，通常在室温下进行，时间约10 - 30分钟。之后用甘氨酸终止交联反应。

 2、细胞裂解：加入细胞裂解液进行细胞裂解，如：贴壁细胞，细胞板刮下后可直接加裂解液冰上裂解； 动植物细胞还需研磨后裂解，可用三维样品研磨仪、三维冷冻研磨仪研磨等仪器研磨破碎，研磨、裂解，均在低温下进行。

3、超声破碎：超声破碎是非常关键的步骤之一，需要把染色质切成较小片段，片段大小一般在200 - 1000bp左右，这样便于后续操作。可用高通量声波基因组剪切仪或非接触超声波DNA打断仪进行操作。

              高通量声波基因组剪切仪                非接触超声波DNA打断仪

染色质超声破碎为何是关键步骤：

1、染色质片段太小或者太大 都会导致后期PCR分析结果呈现假阴性或假阳性。

2、染色质片段太大不利于后续测序分析。

超声破碎如何正确操作：

  采用高通声波基因组剪切仪或者非接触超声波DNA打断仪进行染色质片段破碎。不同的超声功率、不同的超声时间，不同的超声样本，效果都会有所不同。

ChIP-qPCR片段集中在200-700bp，chIP-seq片段集中在150-300bp左右优佳。

1、人全血样本，裂红后进行细胞裂解，释放染色质，然后使用高通声波基因组剪切仪进行超声破碎。样本需要打断到150-300bp左右进行后续实验，设置不同时间、不同上样量，进行梯度预实验。

综合样品的片段长度和荧光强度、片段集中性，20μL打断25min效果极佳。

 4、免疫沉淀： 加入特异性抗体，（选择CHIP实验验证过的抗体）抗体是针对和DNA相互作用的蛋白质的，在4℃下孵育几个小时到过夜，使抗体和目标蛋白 - DNA复合物结合。随后加入可以结合抗体的磁珠或琼脂糖珠，再次孵育，使抗体 - 蛋白 - DNA复合物结合到珠子上。

5、洗涤： 用洗涤缓冲液洗珠子多次，以去除非特异性结合的杂质，洗涤过程要尽量温和，避免破坏蛋白 - DNA复合物。

6、洗脱： 用洗脱缓冲液把蛋白 - DNA复合物从珠子上洗脱下来，得到含有目的蛋白结合的DNA片段的溶液。

7、反交联： 把洗脱下来的蛋白 - DNA复合物在65℃左右孵育几个小时，使DNA和蛋白质之间的交联逆转，让DNA游离出来。

8、DNA纯化回收：用酚 - 氯仿抽提和乙醇沉淀等方法，或者使用商业化的DNA纯化试剂盒，对DNA进行纯化回收，之后就可以用于后续的分析，如PCR、测序等。