Amplite 荧光法Caspase 3/7活性检测试剂盒 蓝色荧光

简要概述

        Amplite 荧光法Caspase 3/7活性检测试剂盒 蓝色荧光是AAT Bioquest研发的用于检测半胱天冬酶活性的试剂盒。半胱天冬酶在细胞凋亡和细胞信号传导中起重要作用，而Caspase 3/7（CPP32 / apopain）的激活对于细胞凋亡的起始是重要的。 Caspase 3/7也被鉴定为筛选靶标。半胱天冬酶抑制剂具有抗ai和其他药理学潜力。已经证明Caspase 3/7对肽序列Asp-Glu-Val-Asp（DEVD）具有底物选择性。

        我们的Amplite™荧光Caspase 3/7检测试剂盒使用Ac-DEVD-AMC作为Caspase 3/7活性的荧光指示剂。AMC肽几乎不发荧光。 Caspase 3/7对AMC肽的切割产生强荧光AMC，其在440-460nm下荧光监测，激发340-350nm。 它可用于使用荧光酶标仪或荧光计连续测量细胞提取物和纯化酶制剂中Caspase 3/7的活性。百萤生物是AAT Bioquest 的中国代理商，为您提供优质的Caspase 检测试剂/试剂盒。

产品说明书

96孔板测定示例

概述

用测试化合物制备细胞（100μL/孔用于96孔板或25μL/孔用于384孔板）

加入等体积的Caspase 3/7测定溶液

在室温下孵育1小时

监测Ex的荧光强度 / Em = 350 / 450nm

操作方法

1.准备细胞：

1.1对于贴壁细胞：在生长培养基中将细胞在20,000至80,000个细胞/孔/ 90L过夜，96孔板或5,000至20,000个细胞/孔/ 20L，用于384孔板。

1.2对于非粘附细胞：从培养基中离心细胞，然后将细胞沉淀悬浮于培养基中，培养基浓度为80,000至200,000细胞/孔/ 90L，用于96孔poly-D赖氨酸平板或20,000至50,000细胞/孔/ 20L用于384孔聚-D赖氨酸板。在实验之前，在制动器关闭的情况下以800rpm离心板2分钟。

注意：应对每个细胞系进行单独评估，以确定诱导细胞凋亡的细胞密度。

2.准备库存解决方案：

2.1在使用前，在室温下使用组分A，B，C（如果需要，组分D）。

2.2如果需要，制备1mM Caspase 3/7抑制剂Ac-DEVD-CHO储备液：将100μLDMSO（未提供）直接加入到Caspase 3/7抑制剂Ac-DEVD-CHO小瓶中（组分D） ）。该抑制剂可用于确认荧光信号强度与Caspase 3/7样蛋白酶活性之间的相关性。

注意：应将未使用的抑制剂储备液等分并在-20°C下干燥储存。

3.准备Caspase 3/7检测溶液：

将50μL200XCaspase 3/7底物储备溶液（组分A）和100μL1MDTT溶液（组分C）加入10mL测定缓冲液（组分B）中，并充分混合。

注意：50μL的200X Caspase 3/7底物储备液足以进行100次分析，每次分析的反应体积为100μL。未使用的200X Caspase 3/7底物储备溶液应等分并在-20°C下干燥储存。远离光明。

4.运行Caspase 3/7测定：

4.1通过在PBS或所需缓冲液中加入10μL10X测试化合物（96孔板）或5μL5X测试化合物（384-板）来处理细胞。对于空白孔（没有细胞的培养基），加入相应量的化合物缓冲液。

4.2将细胞板在37℃，5％CO 2培养箱中培养所需的一段时间（用喜树碱处理的Jurkat细胞4-6小时）以诱导细胞凋亡。

4.3加入100μL/孔（96孔板）或25μL/孔（384孔板）的Caspase 3/7测定溶液（来自步骤3）。

4.4在室温下孵育板至少1小时，避光。

注1：如果需要，在室温下加入测定溶液10分钟前，将1L Caspase 3/7抑制剂Ac-DEVD-CHO的1mM储备液（来自步骤2.2）加入所选样品，以确认caspase 3 / 7个类似的活动。

4.5在制动器关闭的情况下，以800rpm离心细胞板（特别是对于非贴壁细胞）2分钟。

4.6在Ex / Em = 350 / 450nm处观察荧光增加。

数据分析

        从具有细胞的那些孔的值中减去具有生长培养基的空白孔中的荧光。空白孔的背景荧光根据生长培养基或微量滴定板的来源而变化。

图1. Jurkat细胞中Caspase 3/7活性的检测。 Jurkat细胞在同一天以80,000个细胞/孔/ 90L在黑色壁/透明底96孔Costar平板中接种。 用或不用20M喜树碱处理细胞5小时。 加入半胱天冬酶3/7测定溶液（100μL/孔）并在室温下温育1小时。 使用NOVOStar仪器（来自BMG Labtech）在Ex / Em = 350 / 450nm下测量荧光强度。